Агробактериальной трансформация ячменя

Агробактериальной способ доставки ДНК имеет явные преимущества перед другими распространенными методами трансформации растений (баллистическим, электропорация, микроинъекции). Этот метод позволяет вводить в реципиент сравнительно большую генетическую конструкцию, приводит к минимальным нарушениям в кодирующие последовательности гена, переносится, обеспечивает включение в геном реципиента ограниченное число копий чужеродного гена, и наконец, не требует применения специального оборудования.

Агробактериальной механизм переноса генов применяют главным образом к двудольных растений. Использование агробактерии для трансформации однодольных растений до недавнего времени было ограничено. Существует естественный барьер, препятствующий взаимодействия агробактерии и однодольных растений. Предполагается, что это связано с тем, что однодольные растения, в противовес двудольных, либо не выделяются совсем, или выделяют из раненых тканей слишком мало специфических фенольных соединений типа ацетосирингона [1]. Известно, что эти соединения активируют гены вирулентности (vиr-гены) Ти-плазмиды агробактерии. Было высказано предположение о возможности повышения эффективности агробактериальной трансформации за счет добавления ацетосирингона в смесь для совместного культивирования препарата растительных тканей и суспензии агробактерии. Таким образом удалось осуществить агробактериальной трансформацию ряда злаковых культур — риса, кукурузы, ячменя и пшеницы [2-6].

Цель данной работы — оптимизировать и по возможности упростить метод агробактериальной трансформации однодольных растений на примере ячменя.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

За основу генетической агробактериальной трансформации ячменя была взята методика совместного культивирования растительных тканей (експлантив) и агробактерии [7]

Реципиентна система. Как реципиентов использовали семена ячменя (Hordeum vulgare L.) сорт Scarlett, предоставленные Инновационным центром селекции и производства пивоваренного ячменя «Хордес» при Министерстве сельского хозяйства РФ.

Бактериальный материал. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tuimfaciens 3850/рВАЗ, любезно предоставленный профессором Б. А. Левенко (Институт физиологии растений и генетики НАН Украины). Плазмида рВАЗ содержит bar-ген (bialaphos resistance), определяющих устойчивость к фосфинотрицину, активному действующему начала гербицида биалафос (коммерческое название гербицида — "Basta") [8].

Процедура трансформации.Агробактерии течение суток культивировали в жидкой среде LB с добавлением 50 мг / л канамицина и 50 мг / л рифампицина. Культивирование проводили на качалке (150-200 об / мин) в темноте при температуре 28 °.

Экстракт из растений табака получали из выросших в стерильных условиях растений таким образом: листья мелко нарезали, помещали в колбу (50 мл) с жидкой средой МС без гормонов и проводили инкубацию в течение 2 ч на качалке с круговым вращением.

Раствор ацетосирингону стерилизовали фильтрованием через фильтры Millipor (размер пop 0,2 мкм).

Семена ячменя стерилизовали в хлормисному растворе ( «Белье», Россия) в течение 10 мин, что стерилизующий раствор удаляли и семена тщательно промывали стерильной дистиллированной водой (не менее 3 раз) в течение 30 мин. После стерилизации, зерна разрезали поперек скальпелем.

Непосредственно перед проведением трансформации бактериальную суспензию и экстракт из растений табака смешивали в равных соотношениях.

Части зерен, содержащих зародыши, помещали в агробактериальной суспензию с добавлением экстракта из растений табака или ацетосирингону (50 мкм) и выдерживали в условиях вакуума кгс/см2) 1-2 ч. Этот прием используется для заполнения бактериальной суспензией межклеточного пространства препарата зерен.

Совместное культивирование агробактерий и семян проводили на качалке (200 об / мин) в течение 1-2 суток в темноте при температуре 28 °.

После инокуляции семян переносили на стерильную фильтровальную бумагу или ткань для удаления взвеси агробактерий. Затем в течение 7-10 дней их проращивали в световой камере на среде МС (1 / 2 концентрации

минеральных солей, без гормонов) с добавлением 500 мг / л клафорану (Roussel Uclaf, Франция) для ингибирования дальнейшего роста агробактерий и 50 мг / л канамицина ( «Ферейн», Россия) как селективный агент. Культивирование растительного материала проводили в следующих условиях: 24-25 °; освещенность 5 КЛК, продолжительность светового дня 16 час.

Зеленые проростки ячменя высаживали в грунт и выращивали в теплице при температуре 20 ° и продолжительности светового дня 14 ч.

Через 10-15 дней растения опрыскивали раствором гербицида "Basta" (8 мг / л). Растения, устойчивые к гербициду, имели зеленую окраску и продолжали формировать вегетативные органы.

ПЦР-анализ. Материал, полученный из растений, которые обнаружили устойчивость к гербициду, использовали для выделения геномной ДНК по методу Moller et al [9], который затем анализировали методом ПЦР.

Для ПЦР использовали пару праймеров для гена bar (Из AT «Синтол», Москва):

bаr-1 плюс:

5'-TGC-ACC-ATC-GTC-AAC-CAC-TA-3 ';

bar-2 минус:

5'-АС A-GCG-ACC-ACG-CTC-TTG-AA-3 '.

Амплификации проводили в программируемом термоциклери МС2 (ЗАО «ДНК-технология», Москва).

Продукты реакции из реакционной смеси (10 мкл) разделяли электрофорезом в 2%-ном агаризованому гели с бромистым bromide в ТВЕ-буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркер МЗ (123 bp DNA Ladder) Gibco BRL, США. Как негативный контроль в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 5 мкл воды. Как положительный контроль использовали плазмидной ДНК из штамма Agrobacterium tumefaciens 3850/рВАЗ. ПЦР-анализ проводили в трехкратной повторности для каждого образца геномной ДНК зародышей ячменя.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ

За последние годы был выполнен ряд работ по трансформации ячменя, в том числе и агробактериальной методом [10, 11]. В большинстве случаев как реципиенты были использованы незрелые зародыши сорта Golden Promise или полученный из них морфогенные каллус. Впоследствии для получения трансформированных растений необходимо было регенерировать растения с каллуса, что неизбежно связано с длительным культивированием in vitro, использованием фитогормонов и риском проявления сомаклональнои изменчивости.

Долгое время считалось, что на процесс трансформации существенное влияние оказывает повреждения потенциального хозяина. Все попытки провести трансформацию однодольных растений через неповрежденный эпидермис долгое время оставались безуспешными [12]. В 1987 г. была проведена успешная агробактериальной трансформация семян, прорастают, Arabidopsis thaliana [13]. Одним из преимуществ предлагаемого в данной работе метода является отсутствие необходимости использовать поврежденные растения реципиента. Описание метода, а также влияние на него ряда физических факторов и химических агентов приведены в следующих разделах.

Продолжительность сокультивування агробактерий и семян. По результатам наших предыдущих опытов и по литературным данным, оптимальное время трансформации составляет не менее суток [14]. Возможно, именно такое время необходимо для проникновения агробактерий сквозь клеточную стенку однодольных растений, если этот процесс происходит путем ферментативного растворения клеточной стенки [15]. При меньшем времени экспозиции появление трансформированных растений в наших опытах не наблюдалась. Сокультивування течение более 2 суток приводит к резкому увеличению концентрации бактериальных клеток в суспензии и их пагубном воздействии на семена. Так, если после 24 ч инкубации семян в суспензии агробактерий сходят 70% семян ячменя, то через 2 суток-55%, а через 3 суток-15% (усредненные показатели, полученные в данной работе).

Использование в качестве факторов, стимулирующих трансформацию, ацетосирингону и экстракта из растений табака. Некоторые культуры для проведения успешной трансформации, требуют особых условий сокультивування. Так например, для повышения эффективности трансформации сахарного тростника в суспензию, содержащую A. tutnefaciens и експланты, добавляли аскорбиновую кислоту (0,09 мкм) и цистеин (0,33 мкм) [16]. Для успешной агробактериальной трансформации однодольных растений обычно используют ацетосирингон [17-19].

Экстракт из растений табака на практике широко и с успехом применяют при проведении агробактериальной трансформации самый различных видов растений и експлантив. Известно, механически поврежденные и растительные клетки, активно делятся, двудольных растений образуют вещества, индуцируя vиr-гены [20]. Вполне возможно, что экстракт табака является естественным источником подобных веществ.

При обработке семян ячменя суспензией A. tumefaciens, содержащий ацетосирингон или экстракт табака, нами получены устойчивые к канамицину

растения. Зеленые регенеранти высаживали в грунт. Через 10-15 дней культивирования растения обрабатывали гербицидом "Basta" в концентрации 8 мг / л. Растения, устойчивые к гербициду, имели зеленую окраску и формировали вегетативные органы. У части из них ПЦР-анализ подтвердил включение в ДНК растений гена bar (рисунок).

Без использования ацетосирингону или табачного экстракта получить трансформированные растения не удалось (контрольный вариант). Для осуществления трансформации оказалась эффективной искусственная активация генов вирулентности бактерий.

Хотя ацетосирингон и ингибирует определенной степени прорастания семян ячменя, однако частота трансформации растений ячменя в результате данного эксперимента составляет 2%. Этот показатель для однодольных растений соответствует среднему уровню и поэтому является вполне приемлемым. Следует отметить, что при использовании экстракта табака (без ацетосирингону) частота трансформации несколько выше (2,7%).

Применение вакуумной обработки. Применение вакуумной обработки впервые было осуществлено при трансформации Arabidopsis thaliana [21]. Этот способ активно используется для получения трансформированных растений однодольных других видов [14, 22]. Для повышения эффективности трансформации семена выдерживали в агробактериальной суспензии (с добавлением экстракта табака) в условиях вакуума (-1 кгс / см) в течение 1 ч. Цель такой обработки заключалась в облегчении проникновения клеток агробактерий во внутренние ткани зерновкы.

Применение вакуумной инфильтрации дало положительный эффект. Хотя обработка вакуумом немного угнетает прорастание семян, однако частота трансформированных растений достигла 4%. Для однодольных культур это хороший результат.

Наследование введенного гена bar. Все растения ячменя поколения Т0, которые оказались устойчивыми к гербицида "Basta", формировали фертильные семян. В дальнейшем растения следующего поколения сеяли в грунт и также обрабатывали гербицидом. Устойчивыми оказались 80% растений. Во всех устойчивых к гербициду растений ячменя при исследовании препарата геномной ДНК обнаружено присутствие последовательности гена bar, то есть в 80% представителей поколения Т1 происходила экспрессия гена — маркера трансформации. Финские исследователи при анализе трансгенных растений ячменя, полученных методом баллистической трансформации, показали, что 65% растений поколения Т1 наследовали экспрессию гена [23].

Главная особенность предлагаемой технологии трансформации ячменя — это использование семян, прорастают, в качестве реципиентнои системы, благодаря чему трансформационный процедура приобретает ряд технологических преимуществ.

Первая из них заключается в том, что необходимые для трансформации ткани содержатся в сухих семенах, в связи с чем отпадает необходимость выращивать донорно растение в строго контролируемых условиях или получать ткани, компетентны для сокультивування с бактериями. Клетки такой реципиентнои системы компетентные для трансформации со стороны Т-ДНК.

Второе преимущество — это сохранение семенами после внедрения чужеродной ДНК способности к энергичного роста (по сравнению с регенеранти с каллуса) и образованию То-потомства. При получении трансгенных растений традиционным способом, т.е. путем регенерации, проростки обладают значительно менее энергичным ростом, чем побеги из семян, отчего процесс получения поколения Т0 достаточно длительный.

Третьим важным преимуществом предлагаемой технологии является отсутствие этапа регенерации растения в традиционном понимании. Фактически этот этап проходит в форме естественного для любого семян роста и развития, заканчивающийся плодоношения и формированием поколения Т,.

Таким образом, в предлагаемой технологии полностью отсутствуют этапы, связанные с необходимостью культивирования каких-либо тканей in vitro, что позволяет избежать появления сомаклональнои изменчивости, всегда несет с собой опасность неконтролируемого отклонения от исходного генотипа, а также создает возможность для использования данного метода для работы с другими генотипами независимо от морфогенетических потенциала их тканей.

В ходе проведенной работы была оценена возможность применения метода агробактериальной трансформации отношении ячменя; полученные растения ячменя сорта Scarlett, несущих ген bar и устойчивые к гербициду "Basta" в концентрации 8 мг / л. Предлагаемая технология может быть использована в равной мере для трансформации как двудольных, так и однодольных растений.